2020年11月22日，国际知名的植物生物学和生物技术期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了王道文团队题为"Intron-Located MYB Binding Site Is Required for Efficient Expression and Function of a Receptor-Like Kinase in Wheat Powdery Mildew Defense"的研究论文。为了与大家分享这篇文章，本文将对内容进行重新整理，同时不变更原文意。
一个位于内含子中的MYB结合位点是小麦白粉病防御中受体样激酶有效表达和功能的必备
文章摘要
小麦品种：本文涉及的小麦品种包括普通六倍体小麦和四倍体小麦，其中水源11、中国春和小偃54属于六倍体小麦，Stewart属于硬粒四倍体小麦，文中进行遗传转化所用到的品种是Stewart，属于四倍体小麦；
LRK10L-RLKs：LRK10样受体激酶；
TaRLK-R1、 -R2和-R3：属于LRK10L-RLKs，对小麦条锈菌具有抗性作用；
TtdLRK10L-1：本文研究的主角，正体代表蛋白，斜体代表基因，在硬粒小麦品种Stewart中鉴定出来的，在氨基酸序列和一级结构上与LRK10高度相似；
Bgt: Blumeria graminis f. sp. Tritici 的缩写，白粉病致病菌禾苗枯病菌；
MYB-BS：顺式元件，MYB转录因子结合位点；
CL-1、CL-2、CL-3：TtdLRK10L-1 cDNA转基因株系；
GL-1、GL-2、GL-3：TtdLRK10L-1 gDNA转基因株系。
研究背景
植物进化出复杂的天生免疫系统抵御病原体侵袭，该系统可分为模式识别受体触发免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）和效应触发免疫（Effector-triggered immunity，ETI）两种。许多植物受体样激酶（Receptor-like kinases，RLKs）被证明能够感知和应对不同病理系统中入侵病原体的信号。它们通常作为PTI中的模式识别受体（Pattern-recognizing receptors，PRRs），并被特定的病原体迅速激活。根据RD结构域的存在或缺失，植物和动物的RLKs可分为RD激酶和非RD激酶。迄今为止，在基因组较简单的模式植物如水稻和拟南芥中已广泛研究了几种RLKs在病原抗性中的作用。在基因组复杂的作物中，RLKs参与抗病性的研究相对较少。
小麦白粉病是严重制约全球小麦产量的病害。培育和利用抗禾苗枯病菌（f. sp. Tritici）的小麦品种是防治这一病害最有效、经济和环境友好的方法。LRK10-like RLKs （LRK10L-RLKs）最早在小麦及其近缘植物中被报道。LRK10蛋白的主要结构包括一个信号肽、一个富含半胱氨酸的细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个预测的细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。它们定位于质膜，属于非RD激酶。LRK10基因的表达受发育和环境因素调控。大量顺式元件的存在可能与此相关，但目前缺乏相关的实验证据。有研究表明，三种LRK10L-RLKs (TaRLK-R1、 -R2和-R3)对小麦条锈菌（f. sp. tritici）的超敏感抗性具有重要作用。LRK10L-RLKs是否参与小麦对Bgt感染的防御应答尚未明了。
本研究旨在探究LRK10L-RLKs是否在小麦对 Bgt 的防御中发挥作用，以及内含子顺式元件是否影响LRK10L-RLKs的表达和功能。
研究方法
TtdLRK10L-1的结构和表达特征
1.1 转基因受体材料选择
作者曾对六倍体普通小麦中的3种LRK10L-RLKs (TaLRK-R1、-R2和-R3)进行了初步的功能分析。由于普通小麦品种（水源11、中国春和小偃54）基因转化困难，无法深入研究，因此本文作者转向适合农杆菌介导遗传转化的春硬粒小麦品种Stewart，对LRK10L-RLKs进行分析研究。
1.2 研究基因的确定
通过对Stewart种系基因组序列的分析，TRITD1Av1G004220在氨基酸序列和一级结构中与LRK10和TaRLK-R1、-R2和-R3高度相似，因此本文重点研究编码TtdLRK10L-1的TRITD1Av1G004220，后续实验均以此基因为对象。
1.3 基因结构分析
TtdLRK10L-1的结构分析如下：TtdLRK10L-1蛋白包含一个信号肽、一个富含半胱氨酸的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个包含植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶共有的12个亚结构域的细胞内激酶结构域（如图1）。的基因组序列有2个内含子和3个外显子，第一个内含子（intron I, 1015 bp）的大小明显大于第二个内含子（intron II, 191 bp）（如图2a）。
1.4 核心元件分析与功能预测
在NEW PLACE数据库中分析，发现了 TtdLRK10L-1 两个内含子中存在多个预测的顺式元件。这些顺式元件可能参与转录因子结合、非生物胁迫反应、组织特异性表达和植物激素诱导。值得注意的是，一个包含一个MYB转录因子识别序列（TAACTG）和两个W-box转录因子结合元件的MYB-BS仅存在于intron I中。
图1. 预测的TtdLRK10L-1氨基酸序列与普通小麦代表性同系物的比较。
构建和表征两种类型的转基因株系
2.1 转基因材料构建
本研究利用本地启动子构建了两种转基因Stewart小麦品系：cDNA转基因株系和gDNA转基因株系。cDNA转基因株系（CL-1、CL-2、CL-3）表达来自无内含子的TtdLRK10L-1-GFP转基因；而gDNA转基因株系（GL-1、GL-2、GL-3）表达相同的转基因，但其基因组序列中包含两个内含子（图2b）。
2.2 转基因材料基因表达鉴定
通过实时荧光定量PCR（qPCR）、基因组PCR、RT-PCR和蛋白质印迹分析，证实cDNA和gDNA转基因株系中均存在目标基因，且转录翻译活跃（图2c）。值得注意的是，与cDNA转基因株系相比，gDNA转基因株系中TtdLRK10L-1:GFP的蛋白表达水平更高（图2c）。
2.3 转基因材料基因亚细胞定位分析
共聚焦显微镜观察结果显示，在cDNA和gDNA转基因株系的叶片表皮细胞中，TtdLRK10L-1:GFP均靶向质膜（图2d）。小麦叶肉原生质体中表达的TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白也定位于质膜。
图2. TtdLRK10L-1基因组序列及两种转基因植株的鉴定
(a) TtdLRK10L-1相对于LRK10、TaRLK-R1、-R2和R3的外显子和内含子结构。(b) 转基因构建示意图：pNP:TtdLRK10L-1 cDNA -GFP（上）或pNP:TtdLRK10L-1 gDNA -GFP（下）。（c）转基因苗在基因水平、转录水平和蛋白水平上的检测。 (d) TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白在cDNA和gDNA转基因株系叶细胞质膜上的靶向作用。
gDNA转基因株系表现出更高的基因表达和更强的抗白粉病能力
3.1 基因受白粉病接种表达上调（分子机制）
通过RT-PCR和Western blotting分析，发现接种白粉病后，cDNA和gDNA转基因株系中的内源性基因表达在转录水平（图3a）和蛋白水平（图3b）均上调，且gDNA转基因株系上调幅度更大。
3.2 菌落数量（表型结果）
接种白粉病72小时后，cDNA和gDNA转基因株系中的微菌落数量均低于对照组（野生型Stewart和TNS）（图3c）。与野生型Stewart和TNS相比，6个转基因株系接种后第7天叶片上的菌落数量也有所减少（图3d和e）。值得注意的是，GL-1、GL-2和GL-3的生长始终显著低于CL-1、CL-2和CL-3（图3c、d和e），表明gDNA转基因株系表现出更强的抗病性。
3.3 氧化爆发分析
部分穿透（a型）或感染整个细胞（b型）的氧化爆发是宿主细胞防御白粉病感染的重要早期过程。通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色检测H2O2积累，结果显示两种类型的氧化爆发（图4a）。
在接种后24小时，野生型Stewart和TNS对照植株中出现这两种类型氧化爆发的细胞比例最低，cDNA转基因株系居中，而gDNA转基因株系最高；反之，野生型Stewart和TNS对照植株中未发生氧化爆发的细胞（c型）的百分比最高，cDNA转基因株系居中，gDNA转基因株系中最低（图4b）。
图3. TtdLRK10L-1 cDNA （CL-1， -2，和-3）和gDNA （GL-1， -2，和-3）转基因株系对白粉病（Bgt）感染反应的比较分析
（a）qRT-PCR检测基因在接种前(0 h)和接种后两个时间点（24 h和48 h） cDNA和gDNA转基因株系中的表达水平。(b)用GFP特异性抗体免疫印迹法检测6个转基因株系TtdLRK10L-1:GFP融合蛋白。（c）测定6个转基因株系和两个对照材料野生型 Stewart和转基因无效分离苗（TNS）接种后72 h 萌发孢子总数中形成的微菌落百分比。（d）接种7天后，菌落在6个转基因株系和2个对照（野生型 Stewart和TNS）的叶片表面发育情况。(e)对（d）中不同叶片样品，使用ImageJ对菌落的叶面积百分比进行量化。
图4. 诱导的cDNA （CL-1， -2, and -3）和gDNA （GL-1， -2, and -3）转基因株系及两个对照材料野生型 Stewart和转基因无效分离苗（TNS）在病原菌接种48 h后的氧化爆发分析。
(a) 3,3 -二氨基联苯胺染色显示的三种类型的细胞氧化爆裂。a型，部分穿透氧化爆发；b型，氧化爆发分布在整个细胞；c型，没有检测到氧化爆发。(b) 定量比较转基因和阴性对照中a、b、c型细胞氧化爆发的比例。
内含子对TtdLRK10L-1介导的抗白粉病防御的影响
4.1 基于上述结果的推测
上述结果表明，gDNA转基因株系的转基因表达水平高于cDNA转基因株系，同时表现出更强的抗病性，这提示内含子可能参与了基因表达和功能调控。
4.2 对推测进行验证
为了验证这一推测，将TtdLRK10L-1的cDNA编码序列和基因组ORF，以及包含内含子I、内含子II、突变MYB结合位点的内含子I（intronI/mMYB-BS）或突变两个W-box元件的内含子I（intron I/mW-box）（图5a），分别构建到pHZ206载体上，并在一周龄Stewart小麦幼苗叶片中进行单细胞防御试验。
4.3 结果
内含子：增强植物免疫和基因表达的关键角色
瞬时转化细胞中的Haustorium指数（HI）是评估植物抵抗感染的有效指标。如图5b所示，携带完整 TtdLRK10L-1 基因（pHZ206 (VC)）和仅包含内含子 II 的 TtdLRK10L-1 基因（pUbi:TtdLRK10L-1intron II）的植物，其 HI 值最高，展现出最强的抗感染能力。相反，缺乏内含子 I 的植物 (pUbi:TtdLRK10L-1gDNA、pUbi:TtdLRK10L-1intron I 和 pUbi:TtdLRK10L-1intron I/mW-box) 表现出最低的 HI 值，表明内含子 I 在植物防御中发挥着至关重要的作用。而 pUbi:TtdLRK10L-1intron I/mW-box 植物的 HI 值介于两者之间，提示 intron I 中的 W-box 元件可能参与了植物防御反应。
4.4 结论
研究数据表明，内含子 I (如 pUbi:TtdLRK10L-1intron II 中所示) 的缺失会导致植物介导的防御能力显著下降。去除内含子 II (pUbi:TtdLRK10L-1intron I) 或突变 intron I 中的 W-box (pUbi:TtdLRK10L-1intron I/mW-box) 对植物防御功能没有显著影响。突变 intron I 中的 MYB-BS (pUbi:TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS) 会进一步削弱其对防御的促进作用。
图5. 单细胞 Bgt 防御实验分析内含子参与 TtdLRK10L-1 的表达和功能。
(a) 实验中 TtdLRK10L-1 的野生型和突变 ORFs 的结构图。(b) 在单细胞防御试验中表达野生型和 TtdLRK10L-1 突变 ORFs 所赋予的 Haustorium 指数值。
TtdLRK10L-1 intron I 中的 MYB-BS 增强了超级启动子活性
5.1 实验方法
为了研究 TtdLRK10L-1 内含子 I 的功能，我们构建了一系列携带不同 TtdLRK10L-1 基因片段（包括 gDNA、cDNA、intron I、intron II、intron I/mMYB-BS 或 intron I/mW-box）的 SP1300:LUC 载体。该载体含有一个超级启动子驱动的 LUC 报告基因，可用于评估不同 TtdLRK10L-1 基因片段对启动子活性的影响。构建完成后，将载体注射到植物细胞中进行表达分析。
5.2 结果
第一组实验比较了不同 TtdLRK10L-1 基因片段对 LUC 信号的影响 (图6a 和 d)。结果显示，包含 intron I 的基因片段 (SP:TtdLRK10L-1gDNA-LUC 和 SP:TtdLRK10L-1intron I-LUC) 能够显著增强 LUC 信号，表明 intron I 的存在对超级启动子活性至关重要。
第二组实验进一步比较了 MYB-BS 和 W-box 元件对 LUC 信号的影响 (图6b 和 e)。结果显示，SP:Ttd LRK10L-1gDNA-LUC 产生的较高 LUC 信号依赖于 MYB-BS 的存在，而与 W-box 元件无关。
第三组实验对 SP:TtdLRK10L-1intron I-LUC、SP:TtdLRK10L-1intron I/mMYB-BS-LUC 和 SP:TtdLRK10L-1intron I/mW-box-LUC 的 LUC 信号进行了评估 (图6c 和 f)。结果与第二组实验一致，证实了 MYB-BS 在增强 SP:TtdLRK10L-1gDNA-LUC 和 SP:TtdLRK10L-1intron I-LUC 启动子活性方面的关键作用。
5.3 结论
TtdLRK10L-1 intron I 中的 MYB-BS 对增强超级启动子活性至关重要。
图6. 利用 LUC 报告基因分析 TtdLRK10L-1 内含子 I 中的 MYB 结合位点 (MYB-BS) 对超级启动子活性的影响。
(a-c) 超级启动子 (SP) 驱动野生型或突变 ORFs 产生的 LUC 信号。(d-f) 分别对 (a)、(b) 和 (c) 中所示的测定产生的 LUC 信号进行定量分析。
本文通过分析基因 TtdLRK10L-1 的结构和功能，揭示了内含子在植物免疫和基因表达调控中的重要作用。传统观点认为内含子是 RNA 剪接过程中可舍弃的副产物。越来越多的研究表明，内含子在基因表达调控、细胞生长发育等方面发挥着重要功能。本研究以 TtdLRK10L-1 基因为例，为深入理解内含子的功能提供了新的证据。
以下列举了一些关于内含子的研究，感兴趣的读者可以进一步了解：
真核生物的基因转录过程复杂而精细。与原核生物不同，真核生物的 DNA 转录产物 pre-mRNA 包含内含子和外显子序列。pre-mRNA 需要经过 RNA 剪接，去除内含子，连接外显子，最终形成成熟的 mRNA 并翻译成蛋白质。长期以来，人们认为内含子是 RNA 剪接过程中产生的无功能副产物，并在剪接后迅速降解。
真核生物，尤其是高等生物，其基因组中含有大量的内含子。如果内含子仅仅是可 dispensable 的副产物，则与生物进化的规律相悖。近年来，越来越多的研究开始关注内含子的生物学功能。
2019 年 1 月 16 日，《自然》杂志同期发表了两篇关于内含子的研究论文，证明了内含子在营养缺乏条件下的重要作用。研究发现，内含子对于细胞在营养匮乏的稳定期存活至关重要，且这种作用与其所在基因编码的蛋白质无关。
内含子助力基因编辑效率提升
2020年11月22日，发表在《植物通讯》期刊上的研究表明，含有内含子的Cas9蛋白能够显著提升基因编辑效率。研究人员发现，在Cas9蛋白的编码序列中增加13个内含子，能大幅提高编辑效率。实验结果显示，使用不含内含子的Cas9蛋白进行基因编辑时，获得的初代转化体没有表现出敲除突变体的表型。而使用含有内含子的Cas9蛋白进行编辑，70%-100%的初代转化体表现出突变表型。这一研究成果表明，含有内含子的Cas9基因在长春花属等其他植物中也具有高效的应用前景。
Happy Ending & 未来可期
2020年，这个曾经遥不可及的未来，如今只剩下最后的几个小时。我们一起经历了种种挑战，感谢每一位奋战在一线的英雄，感谢每一位默默无闻的守护者。所有的不易，都将成为过去！
2021年，充满希望的未来等待着我们！伯小远将与你一起跨年，一起迎接新的一年。未来，你不想看的文献、不想做的实验，伯小远都愿意为你分担。
祝愿大家在新的一年里，心想事成，大吉大利，牛转乾坤！