1. 含RNA琼脂糖凝胶电泳实验的实验目的 本实验旨在利用植物总RNA的非变性凝胶电泳原理和方法，增强受众对该技术的理解和操作能力。
2. 含RNA琼脂糖凝胶电泳实验的原理 RNA电泳实验可以在变性和非变性两种条件下进行。当使用1.0%至1.4%的凝胶进行非变性电泳实验时，尽管不同的RNA条带能够分离，但无法准确判断它们的分子量。只有在RNA完全变性的情况下，其电泳迁移率才会与分子量的对数呈线性关系。测定RNA分子量需要使用变性凝胶。在需要快速检测所提取总RNA样品完整性时，制备普通1%琼脂糖凝胶即可满足要求。
3. 含RNA琼脂糖凝胶电泳实验所需的材料、仪器和试剂
- 蘑菇总RNA溶液
- 电泳仪、电泳槽、电子天平、移液器、枪头、微波炉、紫外透射检测仪等
- 琼脂糖、1X TAE电泳缓冲液、0.5 μg/ml 溴化乙锭（EB）和10X载样缓冲液
4. 含RNA琼脂糖凝胶电泳实验的实验步骤
- 使用1×TAE电泳缓冲液配制琼脂糖凝胶，并加入1×TAE电泳缓冲液使凝胶表面被液体覆盖。
- 在超净工作台上，使用移液器吸取4 μl总RNA样品并将其滴在封口膜上。在实验台上，加入5 μl 1×TAE电泳缓冲液和1 μl 10X载样缓冲液，混匀后小心加入点样孔。
- 打开电源开关，将电压调至100V，使RNA从负极向正极电泳。约30分钟后，将凝胶放入EB染液中染色5分钟，并用清水稍微漂洗。使用紫外透射检测仪观察RNA电泳结果。
5. 变性琼脂糖凝胶中RNA的检测：实验所需试剂：
- a. MOPS缓冲液（10x）：0.4 mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS）（pH7.0）；0.1 mol/L醋酸钠；10 mol/L EDTA
- b. 上样所需的染料：50%甘油；1 mol/L EDTA；0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
- c.甲醛
- d.去离子甲酰胺
电泳槽清洗步骤：
- 去污剂洗净（通常浸泡过夜）
- 水冲洗
- 乙醇干燥
- 灌入3%H2O2，室温放置10分钟
- 0.1%DEPC水冲洗
6. 实验操作步骤：
- （1）使用70%乙醇彻底清洗制胶用具，晾干备用。
- （2）配制琼脂糖凝胶：
①称取0.5 g琼脂糖，置于干净的100 ml锥形瓶中，加入40 ml蒸馏水，在微波炉中加热使琼脂糖彻底溶解均匀。
②当凝胶凉至60至70℃时，依次加入9 ml甲醛、5 ml 10X MOPS缓冲液和0.5 μl溴化乙锭，充分混合。
③灌制琼脂糖凝胶。
- （3）样品制备：
①取DEPC处理过的500 μl小离心管，依次加入以下试剂：2 μl 10x MOPS缓冲液、3.5 μl甲醛、10 μl去离子甲酰胺、4.5 μl RNA样品，充分混匀。
②将离心管置于60℃水浴中放置10分钟，然后置于冰上2分钟。
③向管中加入3 μl上样染料，充分混匀。
- （4）上样
- （5）电泳：将1x MOPS缓冲液加入电泳槽，并在7.5 V/ml的电压下进行电泳。
- （6）电泳结束后，在紫外灯下观察结果。
7. 案例：
琼脂糖凝胶电泳显示使用五种RNA分离方法从东方罂粟叶中提取的总RNA：CTAB方法（通道1）、SDS方法（通道2）、TRIzol方法（通道3）、Plant RNAout试剂盒方案（通道4），以及改良的Plant RNAout试剂盒方案（通道5）。