一、引物选择基础
1. 选取模板cDNA的保守区域
DNA序列的保守区是通过比较不同物种间相似序定的。在NCBI上搜索同一基因的不同物种，使用序列分析软件（如DNAman）进行比对，相同的序列部分即为该基因的保守区。
2. 引物长度标准
引物长度通常位于15至30个碱基之间，常用范围是18-27bp。不应超过38个碱基，以避免延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶的反应效率。
3. GC含量与Tm值的要求
引物的GC含量应保持在40%至60%之间。Tm值（解链温度）则应接近72℃，这有助于复性条件的优化。GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量差异也不应过大。
4. 引物3′端的位点选择
若用于扩增编码区域，引物的3′端不应终止于密码子的第3位，以避免简并对扩增特异性和效率的影响。
5. 引物3′端的碱基选择
为提高引物的特异性，3′端应优先选择T而非A。当3′端出现错配时，T的引发效率较低，有助于减少错误引发的可能性。
6. 碱基分布
引物序列在模板内应避免相似性过高，尤其是3′端的相似性。为防止错误引发，碱基的分布应尽可能随机，3′端不应有超过3个连续的G或C。
7. 引物的互补性与二聚体
引物自身及引物之间不应存在互补序列，以避免形成发夹结构或二聚体。如无法完全避免，应使△G值小于4.5kcal/mol以减少不良影响。
8. △G值的考量
引物的5′端和中间部分的△G值应相对较高，而3′端的△G值应较低（绝对值不超过9）。这有助于维持双链结构的稳定性并减少错误引发的可能性。
9. 引物5′端的修饰
引物的5′端可以进行一定程度的修饰，如加酶切位点、生物素标记等，而不会明显影响扩增的特异性。3′端则不应进行任何修饰，以确保正确的延伸过程。
10. 扩增产物结构考量
为确保PCR的成功，扩增的单链产物不应形成二级结构。在选择扩增片段时，应避开可能形成二级结构的区域。使用相关软件预测mRNA的稳定二级结构有助于模板的选择。
11. 引物的特异性
设计完引物后，应通过AST检测其与其它基因的互补性，以确保其特异性。仅当确定引物与其他基因无显著互补时，方可进行后续实验。